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Biologie moléculaire

Biologie moléculaire 3 L3 SDV BCM

QuestionAnswer
Composition et structure des acides nucléiques : Quelle est la composition des ADN et ARN? ADN = désoxyribonucléotides ARN = ribonucléotides Bases puriques (G et A), 2 cycles Bases pyrimidiques (C et T/U) Liaisons phosphoesters : hydrolyse liaison par DNase ou RNase, forme liaison par ADN/ARN ligase
Composition et structure des acides nucléiques : Quels sont les caractéristiques communes? Orientation 5’ phosphate vers 3’ OH Liaisons phosphodiesters compose squelette ose-phosphate
Composition et structure des acides nucléiques : Quels sont les caractéristiques qui diffères? Liaisons phosphodiesters moins stable pour ARN Groupement hydroxyle sur le ribose
Composition et structure des acides nucléiques : D'après leurs caractéristiques, comment sont-ils définies? Définition par leur séquence et taille b < kb (génome virus) < Mb (génomes bactériens) < Gb (génome humain) ADN ≈10 nucléotides = oligonucléotides
Composition et structure des acides nucléiques : Quel est la structure des ARN? Simples brins -> structures secondaires ARNm pas structure particulière ARNr, ARNt ou ARNs structures particulières : - Epingle à cheveux - Tige-boucle avec bulge (bourgeon) = base non apparié - Pseudnoeuds
Composition et structure des acides nucléiques : Quel est la structure des ADN? 2 brins complémentaires et antiparallèles Liaisons hydrogènes et hydrophobes A=T et C≡G (- = une liaison hydrophobe) Hélices A, B et Z -> B : plus courant, pas d’hélice = 3,4nm = 10,4pb. Tourne vers la droite Linéaire ou circulaire
Composition et structure des acides nucléiques : Qu'est ce que la compaction de l'ADN? Surenroulement -> supertour : ajoute ou enlève tours d’hélices A droite = sens opposé de l’ADN = ADN surenroulé négativement (dans cellules)
Composition et structure des acides nucléiques : Parmi les enzymes spécifiques, on retrouve les topoisomérases. Quels sont les deux types? Les topoisomérases (coupures et soudures) : • Types I : coupe un brin, relâche molécule • Types II : coupe 2 brins, génère/enlève supertours
Composition et structure des acides nucléiques : Parmi les enzymes spécifiques, on retrouve les nucléases. Lesquels sont-ils selon le substrat et le mode d'action? Les nucléases (hydrolysent) : • Selon le substrat : DNase ou RNase • Selon mode action : exonucléase (digère extrémité) ou endonucléase (coupe intérieur)
Composition et structure des acides nucléiques : Parmi les enzymes spécifiques, on retrouve les nucléases. Quels sont les différents DNase et RNase? DNase I : coupe extrémité 5’P et 3’OH DNase II : coupe extrémité 3’P et 5’OH RNase A : pyrimidine, ARN simple brin RNase III : digère duplexes ARN RNase H : digère ARN complexe ADN/ARN
Composition et structure des acides nucléiques : Parmi les enzymes spécifiques, on retrouve les polymérase. Quels sont les différents types? Les polymérase (synthétisent) : Synthèse : orientation 5’-3’. ADNpol : réplication, matrice ADN, amorce ARN ARNpol : transcription, matrice ADN, pas amorce Transcriptase inverse : transcription inverse, synthétise ADN, matrice ARN, amorce ADN
Composition et structure des acides nucléiques : Parmi les enzymes spécifiques, on retrouve les autres enzymes. Quels sont les différents types? T4 ADN ligase : ligature/religuer molécule ADN. Phosphatase alcaline : déphosphoryle ADN en 5’. T4 polynucléotide kinase : ajout phosphate en 5’.
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Extraction : Qu'est ce? Extraire : isoler/purifier les acides nucléiques, lyse cellule Charge négative due groupement phosphate Solubilité dans l’eau pure et tampon Tris (pH = 7-8)
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Extraction : Quels sont les différents réactifs qui permettent la lyse des cellules? (sans exemples) Détergent (amphiphile) : désorganise les membranes. Agents chaotropique : dénature protéines. Agent réducteur : réduit ponts disulfures (protéine). Hydrolase : enzyme hydrolyse molécule cible.
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Extraction : Quels sont les différents réactifs qui permettent la lyse des cellules? (seulement les exemples) Détergent (amphiphile) : SDS, Triton, Tween Agents chaotropique : urée, sel de guanidium, SDS Agent réducteur : DDT, β-mercaptoéthanol Hydrolase : cellulase, lysozyme
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Extraction : Quel appareil, par exemple, permet l'extraction? Moyen casse les cellules : • Sonicateur : émet ultrason casse les cellules • Presse de French • Chauffer (60°C)
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Purification : Qu'est ce? Purifier : séparer acides nucléiques du reste de la lyse Elimination débris cellulaire par centrifugation -> culot = débris membranaire ; surnageant = ADN, ARN, contaminants… Utilisation enzyme pour éliminer contaminant. Ex : purifier ADN, utilise RNase
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Purification : Comment peut-on séparer les plasmides et quels sont les différentes séparation de protéines ou autres contaminants? Séparer les plasmides -> lyse alcaline qui précipite ADN (culot) Séparation différentielle : solvant organique dénature prot Colonne de chromatographie : gel silice (ADN absorbé) ou échange d’anion (lyse, fixation ADN, lavage éthanol, séchage, élution)
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Quantification : Qu'est ce? Mesure de l’absorbance à 260nm -> Plus élevé pour ADN simple brin = effet d’hyperchromicité
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Quantification : Comment mesure-t-on l'absorbance? Comment calcule-t-on la concentration massique? Mesure absorbance : spectrophotomètre (cuves 1ml), nanodrop (cuves 1µl) Loi de Beer-Lambert : Cm=(A×e)/l Avec : Cm : concentration massique (ng/µl) ; A = 260nm ; e = coefficient d’extinction massique (ng.cm/µL) ; l = trajet optique (cm)
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Quantification : Quels sont les coefficient d'extinction estimatifs? • ADN double brin ≈ 50 ng.cm/µL • ADN simple brin ≈ 33 ng.cm/µL • ARN ≈ 40 ng.cm/µL
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Analyser la pureté : Qu'est ce? Détermination si échantillon contient contaminants ou non. Maximum absorption protéine = 280nm
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Analyser la pureté : Quels sont les ratio pour l'ADN, l'ARN et les autres contaminants? • ADN : 1,8 < A260/A280 < 2 Inf 1,8 = contaminé par protéine, sup 2 = ADN dégradé (effet hyperchrome) • ARN : 2 < A260/A280 < 2,2 • Pour autre contaminant (phénol, EDTA) : 2 < A260/A230 < 2,2
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Séparation par électrophorèse : Que permet le gel d'agarose et que contient-il? Gel agarose : permet voir sur ADN plusieurs formes ou une seule + quantification. Sépare selon la taille (100 à 60 kb) Gel agarose contient tampon Tris, EDTA, TBE ou TEA -> 1% = 1g d’agarose dans 100ml
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Séparation par électrophorèse : Quels sont les tampons de charges utilisé dans les puits d'électrophorèse? Que permet le marqueur de taille? • Glycérol : alourdit échantillon • Colorant : bleu de bromophénole, xylène cyanol ou orange G • Marqueur de taille (DNA Ladders) -> log(taille) = f(distance ADN)
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Séparation par électrophorèse : Comment se passe la migration et le révélation? Migration cuve électrophorèse : ADN migre vers pôle positif Coloration ADN par bromure d’éthidium (BET) -> Intercalant de l’ADN mais il est toxique Révélation du gel/ADN par exposition UV
Les techniques de bases en biologie moléculaire, Séparation par électrophorèse : Quels sont les autres types d'électrophorèse? Electrophorèse capillaire : plus petit, migration rapide, séparation de petit fragment Gel acrylamide : migration verticale, résolution plus importante, petit fragment
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vivo : Comment se fait la réplication de l'ADN in vivo chez les procaryotes et eucaryotes? Semi-conservative : parentaux chez molécules filles Sens 5’-3’ Synthèse continue 3’-5’ -> brin précoce Synthèse discontinu 5’-3’ -> brin retardé
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vivo : Grâce à quoi se fait la réplication de l'ADN in vivo? Hélicase : ouvre double hélice. Prot SSB lie simple brin et protège ADN gyrase : enlève supertours positifs ADNpol : amorce ARN, synthèse ADN par l’ARNpol = primase Brin retardé = fragment Okazaki (ADN+ARN). Exonucléase 5’-3’ ARN. Ligase.
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vitro : Quels sont les réactifs permettant la réplication de l'ADN in vitro? Matrice : ADN à copier Amorces : oligonucléotides (18-25b). Extrémité OH libre. ADNpol : résiste grande T°. Origine Taq pol. Diffère selon processivités (vitesse) et fidélité (erreur) Tampon réaction avec magnésium 4 dNTP en excès et équimolaire
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vitro : Quels sont les deux types d'amorces permettant la réplication de l'ADN in vitro? Amorce sens -> brin matrice 3’-5’ Amorce antisens -> brin complémentaire 5’-3’
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vitro : Quel appareil permet la réplication de l'ADN in vitro? Thermocycleur avec bloc chauffant, couvercle chauffant et interface
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vitro : Qu'est ce que la courbe de fusion de l'ADN bicaténaire? Suivi de la dénaturation avec la température A260 = f(température) Effet hyperchrome : ADN simple brin absorbe plus que double brin Température 94-98% pour dénaturation
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vitro : Qu'est ce que le Tm courbe de fusion de l'ADN bicaténaire? Comment le calcul-t-on? Tm = température où 50% ADN dénaturé Calcule du Tm : • Oligonucléotides < 20nt : Tm = 2(A + T) + 4(G + C) • Oligonucléotides > 20nt : N : nb total nucléotides Tm = 2(A + T) + 4(G + C) = x(1 + (N – 20)/20)
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vitro : Quels sont les différentes étapes? Dénaturation (94-98°C) : 1ère = 5min, puis 30s. Hybridation amorces (45-65°C) : 5°C en dessous Tm amorces, 30s. Elongation (68-72°C) : 15s à 1min/kb.
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vitro : Comment se passe la dénaturation et l'hybridation de l'ADN? Dénaturation par chaleur Hybridation thermique : baisse doucement température Dans la glace brin reste dénaturé
Les techniques d'amplification par PCR, réplication de l'ADN in vitro : Comment se fait le choix des amorces? Taille : 18-25nt Tm : 55°C (50-50°C)/ contient en GC : 40-60% Homologie : pas autre même séquence sur matrice Répétition : max 4 Extrémité 3’ : G/C ds 5 dernière base (pas plus 3) Eviter hybridation sur structure secondaire Tm : < 5°C entre amorces
Les techniques d'amplification par PCR, PCR : Quels sont les calculs de quantité ADN, matrice, produit non définit, amplicon? Cycle 25-35fois. Quantité ADN : ADNn=ADNmatrice x 2^n Matrice n’augmente pas : Mn=M0 Produit non défini : Pn=M0xn Amplicon : An=An-1+(An-1+Pn-1)=M0x(2^n–n–1) La quantité de matrice et de produit non définit est très négligeable au bout de 30 cycles
Les techniques d'amplification par PCR, Application PCR : Qu'est que l'amplification pour analyse? Amplifie séquence ADN pour estimer ADN échantillon départ. Quantification par qPCR Utilisation dans investigation criminelle ou archéologie
Les techniques d'amplification par PCR, Application PCR : Qu'est que que le clonage? Fragment d’intérêt = insert digérer par enzyme restriction Vecteur + insert = ADN recombinants Insert en grande quantité grâce PCR Ajout site de restrictions, en 5’, sur les amorces des amplicons Mutagénèse dirigée
Les techniques d'amplification par PCR, Application PCR : Qu'est que que la mutagénèse dirigé? Mutation à un endroit précis. Amorce porte mutation plus longue. Besoin enlever la matrice avec enzyme DpnI reconnait 5’GATC3’ palindromiques méthylés au A et va les cliver
Les techniques d'amplification par PCR, Application PCR : Comment recherche-t-on une séquence spécifique? Quels sont les utilités? Amplification d’une région particulière pour chercher absence/présence séquence. Utile pour recherche pour clonage, en criminalistique avec profil génétique, en santé ou agroalimentaire.
Les techniques d'amplification par PCR, PCR multiplex : Qu'est ce? Utilisation ou amplification de plusieurs séquences (et amorce) en une réaction. Les amorces ne doivent pas s’hybrider entre elles.
Les techniques d'amplification par PCR, PCR multiplex : Comment sont réalisé les empreintes génétiques? Empreintes génétique crée profils génétique. Réalisées grâce amplification région particulière = répétitions séquences des chromosomes
Les techniques d'amplification par PCR, PCR multiplex : Grâce à quoi sont réalisé les empreintes génétiques? Microsatellites 2-5b répétées orientation directe Minisatellites 10-100b répétées en tandem Amorce fluorescente détecte fragment amplifié par mesure fluorescence Electrophorèse capillaire sépare petit fragment
Les techniques d'amplification par PCR, RT-PCR : Par quel détection se passe le réverse transcriptase PCR? Détection de virus à ARN ou PCR sur ARNm eucaryotes pour étudier par exemple transcription ARN -> ADNc, copie du brin complémentaire.
Les techniques d'amplification par PCR, RT-PCR : Comment se passe le réverse transcriptase PCR? ARN -> ADN simple brin Amorce antisens à ARN, transcriptase inverse synthétise ADNc. Digestion ARN par ARNase pour avoir ADNc simple brin. PCR sur amorce sens
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Qu'est ce la qPCR? (Courbe, Phases) Quantificat° précise matrice initiale Qté ADN = f(nb cycle PCR) 3 phase : exponentiel (100% molécule dupliqué), transitoire (ralentissemt), stationnaire (réact° arrêté) Analyse point finale fin PCR classique qPCR mesure qté ADN après chaque cycle PCR
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Quel est le premier marqueur fluorescent qui peut être utilisé? SYBR Green I : fluorescence quand lié façon non spécifique ADN double brin, proportionnel à la quantité et la taille. Pas intercalent ADN. Mutagénèse dangereux.
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Quel est le second marqueur fluorescent qui peut être utilisé? Marqueur spécifique : sonde = ADNc d’une région intérêt avec marqueur. Sonde TaqMan : extrémité avec fluorophore et autre quencher (désactivateur fluorescence) Taq polymérase activité endonucléase 5’-3’ révèle fluorescence
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Que détecte le thermocycleur? Thermocycleur détecte fluorescence émis par fluorophore jusqu’à 72 réaction en même temps
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Quel courbe obtient pour un tube grâce au thermocycleur? Courbe pour un tube : fluorescence = f(nb cycle PCR) Augmentation après 18-19 cycle Valeur seuil = threshold line CT : valeur courbe coupe valeur seuil. Nombre de cycles pour lequel la quantité ADN accumulé donne un signal détectable
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Quels sont les conditions optimales pour la courbe obtenu grâce au thermocycleur? Courbe standard linéaire (R² > 0,980 ou r > 0,990) Efficacité de l’amplification (90-105%) Reproductibilité du résultat (duplicats-triplicats)
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Comment est réalisé la gamme? Quels sont les différents calculs? Dilut° en série ADN départ (triplicat) Log(fluorescence)=f(nombre cycle) Si doublemt parfait, espace entre les courbes : 2n=facteur dilut° Courbe standard : vérifie condit° optimal qPCR et si courbe bonne pr quantifier échantillons. CT=f(concentration)
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Après la courbe de gamme étalon, on obtient la courbe standard. Dans les valeurs à vérifié quels sont les paramètres du premier? (R) Linéarité des données expérimentales : R² > 0,98 ou r > 0,99 Coefficient détermination R² et coefficient corrélation linéaire r r = 1, tous les points sont sur la droite
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Après la courbe de gamme étalon, on obtient la courbe standard. Dans les valeurs à vérifié quels sont les paramètres du second? (M) La pente de la droite M = - 3,32 Définit l’efficacité de l’amplification : E = 10^(-1/pente)
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Après la courbe de gamme étalon, on obtient la courbe standard. Dans les valeurs à vérifié quels sont les paramètres du troisième? (B) B = valeur du Ct pour une quantité de 1
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Après la courbe de gamme étalon, on obtient la courbe standard. Dans les valeurs à vérifié quels sont les paramètres du quatrième? (E) % Efficacité : (E-1) x 100 90% < % Efficacité < 105% Si faible = mauvaise condition hybridation Si sup 100%, amplification en plus de matrice, non spécifique
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Qu'est ce qu'une courbe de fusion? Vérifie pas amplifié autre chose que molécule d’intérêt Fin PCR, augmente température dénature ADN. Inverse changement température = f(température)
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Quels sont les différentes interprétations en fonction de la courbe de fusion? Si courbe même allure = pas amplification spécifique Si Tm sup amplification région non spécifique Si Tm inf amorces qui forment dimères
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Dans les analyses de données, quels sont les calculs de la quantification absolue? Utilise courbe standard détermine CT Equation de la droite : Ct=M(log⁡(quantité))+b Quantité d’ADN : quantité=10^((Ct-b)/M) Nombre de copies chromosomes ou gènes utilisé pour déterminer la charge virale.
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Dans les analyses de données, quels sont les calculs de la quantification relative quand la méthode ΔCt? Compare échantillon à un contrôle. Analyse augmentation/diminution par rapport contrôle Méthode ΔCt : Ratio(test/contrôle) = 2^(Ct(contrôle)–Ct(test)) = 2^(∆Ct) Ratio permet de dire gène est exprimé x fois plus que le contrôle
Les techniques d'amplification par PCR, qPCR : Dans les analyses de données, quels sont les calculs de la quantification relative quand la méthode 2^(-ΔΔCt)? Pas plus 5% ≠ entre efficacité amplificat° gène réf et gène test. ΔCttest=Ct(x,test)–Ct(ref,test) ΔCtcont=Ct(x,cont)–Ct(ref,cont) ΔΔCt=ΔCtest–ΔCtcont Ratio normalisé=2^(-ΔΔCt). Donne ≠/variat° express° entre 2 condit° normalisé à une réf (gène ménage)
Les techniques de clonage : En quoi consiste le clonage? Que nécessite-il? Consiste insérer fragment intérêt dans un vecteur Nécessite extraire et purifier vecteur et ADN inséré
Les techniques de clonage : Quels sont les méthodes qui permettent de récupérer et cloner un insert? Avec quoi est transformé l'ADN? Méthode pour récupérer et cloner l’insert : - Digérer avec enzymes restrictions - Amplifier par PCR séquence intérêt ADN ligase -> ADN recombinant Isolement ADN recombinant en transformant cellules avec antibiotiques et gène résistance
Les techniques de clonage : Quels sont les enzymes de restrictions? Endonucléase naturellement produites Système modification/restriction = mécanismes défenses bactéries contre infection phage Reconnait séquence spécifique de 4-8pb Séquence = palindrome, coupe 2 brins à la même position
Les techniques de clonage : Quels sont les différentes extrémité que l'on peut obtenir avec enzymes de restrictions par exemple? Extrémité cohésive, bout franc ou protubérante
Les techniques de clonage, vecteurs de clonage : Comment se passe l'introduction du vecteur dans le plasmide? Que faut-il? Dérivés plasmides naturels. Introduit par transformation ou conjugaison. Besoin d’une origine de réplication, marqueur de sélection et multisite de clonage (MCS)
Les techniques de clonage, vecteurs de clonage : Qu'est ce qu'un plasmide navette? Comment orienter l'insert? Qu'est ce qu'un site rapporteur? Plasmide navette : ori bactérien + séquence réplication levure Enzymes différentes pour orienter l’insert Sites rapporteurs : lacZ, insert introduit ou non. Si oui, lacZ inactif -> colonie blanche
Les techniques de clonage, vecteurs de clonage : Pour quoi sont utilisés les vecteurs phagiques? Qu'est ce qu'un phagemide et un cosmide? Utilise clone de phage. Ex : phage T7 ou λ Phagemide : plasmide avec origine phage M13 = produit plasmide simple brin Cosmide : site cos = plasmide encapsidé par phage. Plasmide plus grand (15-25kb)
Les techniques de clonage, vecteurs de clonage : Quels sont les deux chromosomes artificiel que l'on peut retrouver? BAC : bactérie, insert ≈300kb. Maintenu comme chromsme (grand). Ori = autonome. Système partit° (stabilise ds cellule) YAC : levure, fragmt ADN ≈1000kb. Télomère extrémité, centromère, site clonage multiple, site rapporteur et séquence réplicat° autonome
Les techniques de clonage : Qu'est ce que la transformation? Transfert horizontale de gène. Insertion dans une bactérie Cellule avec plasmide = transformant Fragiliser membranes rend cellules compétentes (permet acquérir ADN étranger)
Les techniques de clonage : Quelles sont les deux types de cellules que l'on peut retrouver dans la transformation? Cellules chimiocompétentes : agent chimique, choc thermique Cellules électrocompétentes : choc électrique
Les techniques de clonage : Qu'est-il important d'avoir pour la cellule hôte et la sélection? Machine réplication, réplisome compatible avec Ori. Chromosome code galactosidase = blanc-bleu Cellule sensible ampicilline car sélection cellules résistantes à l’antibiotique
Les techniques de clonage : Dans les cellule hôte et la sélection, quels sont les différentes caractéristiques du génomes que l'on peut retrouver? Δ : délétion d’une région Φ80 : phage 80 gyrA : résistance à l’acide nalidixique recA : plasmide monomérique endA :pas de produit dégradé hsdR : pas dégradation ADN
Les techniques de clonage : Que permettent les vecteurs d'expression? Quel exemple peut-on avoir? Production d’ARN ou protéines Ex : promoteur phage T7 reconnu par ARN pol T7
Les techniques de clonage : Quels sont les caractéristiques des vecteurs d'expression? Site clonage multiple : code prot Marqueur sélect° : antibiotique Ori : maintient plasmide Promoteur fort et inductible (induit l’express° prot). Hybride ou de phage Etiquette de purificat° et détect° Peptide signal : adresse prot dans périplasme
Les techniques de clonage, banque d'acide nucléique : Qu'est ce que la banque génomique? Caractérise séquence particulière, établit carte physique génome, séquençage génome partiel ou total
Les techniques de clonage, banque d'acide nucléique : Qu'est ce que la banque ADNc? Crée à partie population ARNm Extraire et purifier ADN génomique par : séquençage haut débit ou digestion par enzyme de restriction + clone Permet étude différents fragments
Created by: Julie.Lam
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